作业帮真核生物的基因在E.coli中如何表达需要注意什么,用什么酶切合适，切口是平末端还是粘性末端？导入时需要注意什么？
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/04/30 16:01:50
真核生物的基因在E.coli中如何表达需要注意什么,用什么酶切合适，切口是平末端还是粘性末端？导入时需要注意什么？
真核生物的基因在E.coli中如何表达
需要注意什么,
用什么酶切合适，切口是平末端还是粘性末端？导入时需要注意什么？
真核生物的基因在E.coli中如何表达需要注意什么,用什么酶切合适，切口是平末端还是粘性末端？导入时需要注意什么？
首先提取你要的目标真核生物的mRNA,然后做反转录PCR,设计引物的时候注意上游引物要包含启动子和下游引物要包含终止子,这样才能获得完整的编码序列.然后你需要将你的反转录PCR产物进行序列测定,当然如果你这个是已知序列则可以不去测序,但你必须保证你有这个基因的完整开放可读框序列信息.接着,选择载体和宿主菌.目前在E.coli中进行原核表达的时候,最常用的菌株是BL21(DE3),载体对应PET系列.选择好你的载体后,你需要分析你要表达的基因的序列中含有哪些酶切位点和载体上的多克隆位点.然后,选择个内切酶,内切酶选择的要求有两个,一要是载体上多克隆位点有酶切位点的,二是你的序列中没有这两个酶的酶切位点.接着,就是人工在你的序列末端添加这两个酶的酶切位点,你需要重新设计引物,在原来第一次设计的引物基础上分别在上下游引物前面带上这两个酶切位点序列（上游一个,下游一个,不能随便加,你要查看多克隆位点的酶的排列顺序,上游引物前面加排在前面的酶切位点,下游引物加后面的）.记住,上下游引物前面的酶切位点一定不能搞错,不然你连接到载体上的时候会导致序列连反!加上酶切位点后还要在前面加上保护碱基,以确保内切酶能够完整的切出片段的酶切位点,保护碱基序列可以去查询相关内切酶的资料.接着用设计好的第二次引物使用第一次RT－PCR产物作为模板进行PCR扩增.得到的产物纯化后用选择的酶进行双酶切,同时也要对载体DNA用同样的两种内切酶进行双酶切.酶切结束后,分别纯化载体片段和PCR产物片段,然后进行连接.此时可以制作感受态细胞,连接结束后开始做转化.经过PCR筛选和双酶切鉴定得到阳性的菌株后,就可以进行液体培养诱导表达了.PET系统基本上都是用IPTG作为诱导物的,将阳性克隆接到含有相应抗性的液体LB培养基中37度培养3小时,然后加入0.1.0mM终浓度的IPTG,再培养4小时左右一般你就能拿到表达产物了.
原核表达的大体流程就是这样,对于酶的选择,主要是根据我们自己在产物前面添加的酶切位点来选择的.为了增加连接效率,做双酶切的时候,我们一般选择的是切出黏性末端的酶,这样载体和插入基因的两端都带有了不同的黏性末端,在连接的时候载体就不会容易发生自连接,插入片段也不会插反.导入的方法参照一般大肠杆菌氯化钙法转化就行了.
正好我最近就在做这个,如果楼主也要做的话我们可以探讨下.
把真核生物基因的编码区切下来，连进一个原核表达载体的Promoter和PolyA之间，转染Ecoli。注意看表达载体的说明，确保你的片断在载体能load的片段长度范围内
必须是mRNA反转录的DNA或类似的DNA基因，必须与大肠杆菌启动子、RBS序列、SD序列、起始密码子正确拼接、应该还有大肠杆菌终止子。最后还要转入大肠杆菌中才可能正确表达。