作业帮蛋白过镍柱纯化的过程中 咪唑是哪部用的啊 什么原理啊 谢谢大家!
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/08 16:00:38
蛋白过镍柱纯化的过程中 咪唑是哪部用的啊 什么原理啊 谢谢大家!
蛋白过镍柱纯化的过程中 咪唑是哪部用的啊 什么原理啊 谢谢大家!
蛋白过镍柱纯化的过程中 咪唑是哪部用的啊 什么原理啊 谢谢大家!
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合.
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度.咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用400mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里.
这是我的经验,楼主可以多方面参考下别人的.喜欢推荐我的答案哦,\(≧▽≦)/~
见链接
http://zhidao.baidu.com/question/328598762.html
查多点文献，binding buffer里面有些人会加5-20mM的咪唑的，也有不加的。你做一个梯度洗脱，看看哪个mM的咪唑能把大部分的杂蛋白洗下来，也就是wash buffer，一般可以设20，,30，40,50.... 最后是elution buffe，把你的目的蛋白洗下来r。原理就是竞争洗脱